逆转录病毒转染法建立耐药性人膀胱癌细胞系
作者：易善红 杨唐俊 何斌 潘进勇 曾毅
单位：易善红 杨唐俊 何斌 潘进勇 曾毅(第三军医大学第二附属医院泌尿外科 重庆 400037)
关键词：膀胱肿瘤；多药耐药性；逆转录病毒；基因转移；肿瘤细胞，培养的
肿瘤000402 摘要：目的 建立高效、稳定的人膀胱癌多药耐药性细胞模型。方法 应用逆转录病毒转染法建立人膀胱癌耐药性细胞模型；MTT法检测细胞系在不同化疗药物作用下的生存率，免疫组化检测肿瘤的P-GP表达，原位杂交检测肿瘤细胞mdr1 mRNA的表达量，PCR检测mdr1基因转移至细胞基因组片段。结果 转基因细胞系对阿霉素、秋水仙素的耐药性分别提高8倍和21倍，免疫组化示转基因细胞系P-GP表达量增强，原位杂交结果示肿瘤细胞内mdr1 mRNA的表达量明显增加，PCR表明基因转移后细胞内能扩增出mdr1片段。结论 逆转录病毒转染法，是建立人膀胱癌多药耐药性细胞模型的一种较理想的方法。
, 百拇医药
中图分类号：R965.1 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)04-0241-04
MDR HUMAN BLADDER CANCER CELLS LINE ESTABLISHED BY RETROVIRUS INFECTION
YI Shan-hong
(Department of Urology,Xinqiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400037,China)
YANG Tang-jun
(Department of Urology,Xinqiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400037,China)
, 百拇医药
HE Bin, et al.
(Department of Urology,Xinqiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400037,China)
Abstract：Objective To establish a MDR human bladder cancer cells line.Methods Human bladder cancer cells were transfected by mdr1 retrovirus supernatant. Multidrug resistance of cancer cells was tested by MTT assay; expression of P-GP on membrane and mdr1 mRNA in cells was detected with immunocytochemistry and in situ hybridization. The presence of mdr1 cDNA in genome of pT24mdr1 was detected by polymerase chain reaction (PCR). Results The pT24mdr1 cell line was found to be 8 times more resistant to adriamycin and 21 times to colchicine than T24, and showed stable resistance to both adriamycin and colchicine; through immunocytochemistry assay with McAb against P-GP, pT24mdr1 cells expressed P-GP higher than T24 on the membrane. The pT24mdr1 cells showed much higher mdr1 mRNA level in contrast to T24 by in situ hybridization. The result of polymerase chain reaction verified the presence of mdr1 cDNA in genome of pT24mdr1.Conclusion Gene transfer by retrovirus is a satisfied method in establishing MDR human bladder cancer cells line.
, 百拇医药
Key words： Bladder neoplasma; Multidrug resistance; Retrovirus; Gene transfer; Tumor cells,cultured
人类肿瘤化疗效果不理想的一个主要原因是由于多药耐药性(Multidrug Resistance,MDR)的产生，目前认为MDR主要和mdr1基因编码的P-糖蛋白(P-GP)有关[1]。本研究采用逆转录病毒转染向膀胱癌细胞T24内转移mdr1基因，秋水仙素耐药性筛选，并建立转基因细胞系pT24mdr1，探讨多药耐药性的P-GP机理，为逆转细胞的多药耐药性提供高效、稳定的MDR人膀胱癌细胞模型。
材料与方法
一、T24为浸润性人膀胱癌细胞，北京医科大学泌尿外科研究所惠赠。质粒pHaMDR1/A为带有mdr1 cDNA全序列的逆转录病毒载体，经导入细胞后表达全长的mdr1 mRNA[2]。质粒pHDR5A携带有1386 bp长mdr1基因片段，经酶切后获得的片段用于制作分子杂交探针。PA317、NIH3T3细胞，第三军医大学分子生物教研室提供。
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二、引物 mdr1基因核酸序列本科设计[3]，上游引物设在mdr1基因的第21外显子上，序列为5′-CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG-3′，下游引物设在mdr1基因的第22外显子上，序列为5′-GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA-3′，扩增的片段长度为157 bp。
三、病毒包装、收集及滴度测定 采用脂质体转染试剂DoTaP介导，将pHaMDR1/A重组逆转录病毒载体DNA导入包装细胞系PA317细胞，并以60 ng/ml秋水仙素选择性筛选。细胞生长达80%融合，收集细胞培养上清液：经0.45μm孔径的过滤器过滤，-70℃保存。NIH3T3法测定病毒滴度。
四、病毒上清液RNA的鉴定及辅助病毒检测 参照TriPureTM试剂盒说明提取病毒上清液RNA，逆转录合成cDNA，所得产物用于PCR扩增，循环参数为94℃×50s,55℃×50s，72℃×60s，共35个循环。2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。收集转染阳性NIH3T3细胞的培养上清液，0.45 μm微孔过滤器过滤后再次感染NIH3T3的亲代细胞，秋水仙素筛选，观察有无细胞克隆生成。
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五、转染T24细胞 对数级生长的T24细胞中加入含8 μg/ml聚凝胺的病毒上清液1 ml，吸附约12 h；新鲜培养液培养48 h后，加用秋水仙素60 ng/ml选择培养，筛选出转染阳性细胞，命名为pT24mdr1。
六、细胞生物学特性及耐药性分析 分别测定T24、pT24mdr1细胞的生长曲线，计算各自的倍增时间；记录细胞的生长条件，观察两细胞的消化特性。MTT法检测细胞对阿霉素(ADM)、秋水仙素(COL)的耐药性。
七、P-GP免疫细胞化学染色：SP法染色。
八、原位杂交检测细胞内mdr1 mRNA的表达 质粒pHDR5A转化、提取、纯化、限制性酶切并回收片段，应用地高辛进行标记，检测细胞mdr1 mRNA的表达。杂交结果判断：细胞浆内呈现紫兰色颗粒者为阳性信号，阴性不着色。
九、PCR检测细胞基因组DNA：引物同前。TriPure[TM]试剂盒说明提取细胞总DNA，扩增条件：96℃预变性3 min，94℃变性50s,55℃退火50s，72℃延伸60s，PCR扩增35个循环，72 ℃延伸9 min。所得产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。
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结果
一、病毒上清液的收集、浓缩及滴度测定 经DoTaP介导将pHaMDR1/A重组逆转录病毒载体DNA转染PA317细胞，以秋水仙素作耐药性筛选得到抗性克隆，命名为PAmdr1。细胞培养液经过滤，获病毒上清液，NIH3T3细胞感染法测定其滴度为3.1×105 CFU/ml。
二、病毒上清液RNA的鉴定和辅助病毒检测 PAmdr1细胞的培养上清液RNA扩增出特异性mdr1 157 bp条带，PA317细胞未扩增出此特异性的条带(见图1)。以转染阳性的NIH3T3细胞的培养液进一步感染亲代细胞NIH3T3，未出现抗性细胞。
图1 各细胞培养上清液RNA的RT-PCR结果
←为mdr1 157bp 1.复华DNA Marker
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2.pAmdr1细胞 3.pA317细胞
三、逆转录病毒对T24细胞的转染 感染12 h之后换用筛选液(COL终浓主为60 ng/ml)，第2天出现大量的悬浮细胞，第7天基本无悬浮细胞出现。第4周开始有细胞增生，并出现细胞岛，转移其中较大的一个细胞岛至另一培养瓶中，继续COL筛选，将此克隆细胞命名为pT24mdr1。
四、细胞的生长曲线及生物学特性 同亲代细胞T24相比，pT24mdr1的形态无明显的变化，细胞内无明显的颗粒及空泡；二者的生长曲线大致相同，细胞倍增时间分别为24.2和25.1 h；两细胞的消化特性及培养条件也无差别。
五、细胞的耐药性 pT24mdr1细胞在ADM浓度小于0.78 μg/ml时，与T24细胞相比细胞存活率出现了显著性差异(P<0.01)，半数致死量(IC50)值分别为1.62、0.199 μg/ml。pT24mdr1细胞在COL浓度小于3000 ng/ml时，与T24细胞相比有显著性差异(P<0.01)，两细胞对COL的IC50值分别为740、33 ng/ml。
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六、免疫组化对细胞膜P-GP的检测 T24细胞染色为弱阳性，pT24mdr1细胞为强阳性染色。
七、原位杂交检测细胞内mdr1 mRNA的表达 pT24mdr1细胞可见很强的胞浆颗粒状着色，呈蓝紫色，主要位于细胞浆内，以核周染色较深。T24肿瘤细胞也可见到胞浆内蓝紫色的着色，较pT24mdr1染色明显浅淡(见封三图1)。
图1 pT24 mdr 1细胞原位杂交结果.(mdrl DNA探针)
八、PCR检测pT24mdr1细胞基因组中mdr1cDNA pT24mdr1细胞出现mdr1 cDNA的157 bp扩增条带，T24细胞则无此条带，见图3。
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图3 细胞基因DNA的PCR结果
1.pGEM-725(+)+HaeⅡ marker
2.pT24mdr1细胞 3.T24细胞
讨论
应用体外抗癌药物诱导方法建立MDR肿瘤细胞模型，能较好地模拟人类肿瘤化疗过程中经常发生的多药耐药现象，具有重要的意义[4]。但用此方法建立的MDR细胞系，诱导时间较长，诱导后细胞的生物特性与敏感细胞发生差异，当处于无化疗药物培养时稳定性较差，耐药性往往发生丢失[5]。我科于1994年应用大剂量ADM短暂冲击结合低浓度持续递增法建立的耐药细胞系[6]，再经连续观察3年，发现细胞耐药性丢失达70%。
生物转基因方法中，逆转录病毒载体是应用最广泛的载体之一。逆转录病毒的细胞感染率高，导入的基因拷贝数多，外源基因表达稳定。特别是该病毒仅能感染分裂相细胞，对生长分裂旺盛的肿瘤细胞更具有良好的选择性和转高的转移率[7]。本研究以DoTaP介导将携带mdr1基因的重组逆转录病毒载体pHaMDR1/A导入PA317包装细胞，并获得逆转录病毒上清液。NIH3T3细胞的培养上清液中未能扩增出mdr1的特异性的条带，再感染实验也表明无细胞克隆形成，即mdr1逆转录病毒上清液仅具有一次性的感染能力(无辅助病毒产生)。以上结果表明，此逆转录病毒上清液不仅含有mdr1基因，而且能安全、有效地应用于实验。
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本研究应用逆转录病毒载体系统介导的基因转移技术，将mdr1基因导入人膀胱癌细胞系T24，经用60 ng/ml秋水仙素选择性培养基筛选，建立了pT24mdr1细胞系。P-GP免疫细胞化学染色显示膀胱癌细胞T24呈现弱阳性染色，说明T24细胞有较弱的原发性耐药表型，能够表达一定量的P-GP。但细胞系pT24mdr1组化染色为强阳性，这说明pT24mdr1细胞在转基因之后P-GP的表达大量增加。原位杂交以mdr1 cDNA的酶切片段作为探针检测细胞mdr1 mRNA，结果表明，pT24mdr1细胞内mdr1 mRNA的表达量增加明显。尤其是pT24mdr1细胞系基因组DNA的PCR产物电泳显示，存在有mdr1 cDNA特异性的157bp扩增片段，这表明mdr1表达已整合到细胞基因组DNA。pT24mdr1细胞系也表现出较强的MDR表型，对COL的耐药性增高21倍，对ADM的耐药性增加8倍以上，较我科以药物诱导建立的耐药性细胞系BIU-87/ADM的耐药强度大大提高。从实验结果看，转入的mdr1基因得到了高表达，细胞的mdr1 mRNA及P-GP的表达量显著增加，细胞对化疗药物的耐药性也显著提高，从而证明mdr1基因编码的P-GP，是细胞产生多药耐药性的主要机制之一。
, 百拇医药
本研究以秋水仙素作耐药性筛选，筛选成功后pT24mdr1细胞对秋水仙素的IC50为740 ng/ml，是耐药性筛选药物浓度60 ng/ml的10倍。半年内pT24mdr1细胞一直处于无化疗药物接触条件下培养，经消化传代近40次，该细胞的多药耐药性无明显降低，说明细胞的耐药性较稳定。本实验还显示转染基因前后的T24细胞形态、生长条件、细胞倍增时间以及消化特性等生物学特性均未发生明显的改变，证明逆转录病毒介导的基因转移对细胞的生物学特性并无影响。这种特性是药物诱导的MDR细系所不具备的。该细胞系的建立为深入研究MDR逆转提供了一个高效、稳定的细胞模型。
基金项目：本课题受97年国家自然科学基金资助。
作者简介：易善红，男，硕士，主治医师，讲师。
参考文献
[1]Roninson LB, Chin JE, Choi K, et al. Isolation of human mdr DNA sequences amplified in multidrug-ressistant KB carcinoma cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1986,83:4538
, http://www.100md.com
[2]Pastan I, Gottesman MM, Ueta K, et al. A retrovirus carrying an MDR1 cDNA confers multidrug resistance and polarized expression of P-glycoprotein in MDCK cells〔J〕. Proc Natl Acad USA,1988,85:4486
[3]何 斌，金锡御，杨唐俊，等.核酶对MDR1基因的体外割活性〔J〕.中华泌尿外科杂志，1999，1：23
[4]Kohichi K, Seiji N, Tsukasa S, et al. Establishment and characterization of doxorubicin resistance human bladder cancer cell line, KK47/ADM〔J〕^ J Urol,1992,148:441
, http://www.100md.com
[5]Kiura K, Ohnoshi T, Tabata M, et al. Establishment of an adriamycin-resistant subline of human small cell lung cancer showing multifactorial mechanisms of resistance〔J〕. Acta Med Okayama,1993,47(3):191
[6]杨唐俊，杨清浩，范立新，等.人膀胱癌BIU-87细胞多药耐药性的形成〔J〕.中华泌尿外科杂志，1996，17(9)：527
[7]Miller AD. Human gene therapy comes of age〔J〕. Nature,1992,357:455
(收稿日期：1999-11-24；修回日期：2000-01-07), http://www.100md.com
单位：易善红 杨唐俊 何斌 潘进勇 曾毅(第三军医大学第二附属医院泌尿外科 重庆 400037)
关键词：膀胱肿瘤；多药耐药性；逆转录病毒；基因转移；肿瘤细胞，培养的
肿瘤000402 摘要：目的 建立高效、稳定的人膀胱癌多药耐药性细胞模型。方法 应用逆转录病毒转染法建立人膀胱癌耐药性细胞模型；MTT法检测细胞系在不同化疗药物作用下的生存率，免疫组化检测肿瘤的P-GP表达，原位杂交检测肿瘤细胞mdr1 mRNA的表达量，PCR检测mdr1基因转移至细胞基因组片段。结果 转基因细胞系对阿霉素、秋水仙素的耐药性分别提高8倍和21倍，免疫组化示转基因细胞系P-GP表达量增强，原位杂交结果示肿瘤细胞内mdr1 mRNA的表达量明显增加，PCR表明基因转移后细胞内能扩增出mdr1片段。结论 逆转录病毒转染法，是建立人膀胱癌多药耐药性细胞模型的一种较理想的方法。
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中图分类号：R965.1 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)04-0241-04
MDR HUMAN BLADDER CANCER CELLS LINE ESTABLISHED BY RETROVIRUS INFECTION
YI Shan-hong
(Department of Urology,Xinqiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400037,China)
YANG Tang-jun
(Department of Urology,Xinqiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400037,China)
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HE Bin, et al.
(Department of Urology,Xinqiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400037,China)
Abstract：Objective To establish a MDR human bladder cancer cells line.Methods Human bladder cancer cells were transfected by mdr1 retrovirus supernatant. Multidrug resistance of cancer cells was tested by MTT assay; expression of P-GP on membrane and mdr1 mRNA in cells was detected with immunocytochemistry and in situ hybridization. The presence of mdr1 cDNA in genome of pT24mdr1 was detected by polymerase chain reaction (PCR). Results The pT24mdr1 cell line was found to be 8 times more resistant to adriamycin and 21 times to colchicine than T24, and showed stable resistance to both adriamycin and colchicine; through immunocytochemistry assay with McAb against P-GP, pT24mdr1 cells expressed P-GP higher than T24 on the membrane. The pT24mdr1 cells showed much higher mdr1 mRNA level in contrast to T24 by in situ hybridization. The result of polymerase chain reaction verified the presence of mdr1 cDNA in genome of pT24mdr1.Conclusion Gene transfer by retrovirus is a satisfied method in establishing MDR human bladder cancer cells line.
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Key words： Bladder neoplasma; Multidrug resistance; Retrovirus; Gene transfer; Tumor cells,cultured
人类肿瘤化疗效果不理想的一个主要原因是由于多药耐药性(Multidrug Resistance,MDR)的产生，目前认为MDR主要和mdr1基因编码的P-糖蛋白(P-GP)有关[1]。本研究采用逆转录病毒转染向膀胱癌细胞T24内转移mdr1基因，秋水仙素耐药性筛选，并建立转基因细胞系pT24mdr1，探讨多药耐药性的P-GP机理，为逆转细胞的多药耐药性提供高效、稳定的MDR人膀胱癌细胞模型。
材料与方法
一、T24为浸润性人膀胱癌细胞，北京医科大学泌尿外科研究所惠赠。质粒pHaMDR1/A为带有mdr1 cDNA全序列的逆转录病毒载体，经导入细胞后表达全长的mdr1 mRNA[2]。质粒pHDR5A携带有1386 bp长mdr1基因片段，经酶切后获得的片段用于制作分子杂交探针。PA317、NIH3T3细胞，第三军医大学分子生物教研室提供。
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二、引物 mdr1基因核酸序列本科设计[3]，上游引物设在mdr1基因的第21外显子上，序列为5′-CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG-3′，下游引物设在mdr1基因的第22外显子上，序列为5′-GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA-3′，扩增的片段长度为157 bp。
三、病毒包装、收集及滴度测定 采用脂质体转染试剂DoTaP介导，将pHaMDR1/A重组逆转录病毒载体DNA导入包装细胞系PA317细胞，并以60 ng/ml秋水仙素选择性筛选。细胞生长达80%融合，收集细胞培养上清液：经0.45μm孔径的过滤器过滤，-70℃保存。NIH3T3法测定病毒滴度。
四、病毒上清液RNA的鉴定及辅助病毒检测 参照TriPureTM试剂盒说明提取病毒上清液RNA，逆转录合成cDNA，所得产物用于PCR扩增，循环参数为94℃×50s,55℃×50s，72℃×60s，共35个循环。2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。收集转染阳性NIH3T3细胞的培养上清液，0.45 μm微孔过滤器过滤后再次感染NIH3T3的亲代细胞，秋水仙素筛选，观察有无细胞克隆生成。
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五、转染T24细胞 对数级生长的T24细胞中加入含8 μg/ml聚凝胺的病毒上清液1 ml，吸附约12 h；新鲜培养液培养48 h后，加用秋水仙素60 ng/ml选择培养，筛选出转染阳性细胞，命名为pT24mdr1。
六、细胞生物学特性及耐药性分析 分别测定T24、pT24mdr1细胞的生长曲线，计算各自的倍增时间；记录细胞的生长条件，观察两细胞的消化特性。MTT法检测细胞对阿霉素(ADM)、秋水仙素(COL)的耐药性。
七、P-GP免疫细胞化学染色：SP法染色。
八、原位杂交检测细胞内mdr1 mRNA的表达 质粒pHDR5A转化、提取、纯化、限制性酶切并回收片段，应用地高辛进行标记，检测细胞mdr1 mRNA的表达。杂交结果判断：细胞浆内呈现紫兰色颗粒者为阳性信号，阴性不着色。
九、PCR检测细胞基因组DNA：引物同前。TriPure[TM]试剂盒说明提取细胞总DNA，扩增条件：96℃预变性3 min，94℃变性50s,55℃退火50s，72℃延伸60s，PCR扩增35个循环，72 ℃延伸9 min。所得产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。
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结果
一、病毒上清液的收集、浓缩及滴度测定 经DoTaP介导将pHaMDR1/A重组逆转录病毒载体DNA转染PA317细胞，以秋水仙素作耐药性筛选得到抗性克隆，命名为PAmdr1。细胞培养液经过滤，获病毒上清液，NIH3T3细胞感染法测定其滴度为3.1×105 CFU/ml。
二、病毒上清液RNA的鉴定和辅助病毒检测 PAmdr1细胞的培养上清液RNA扩增出特异性mdr1 157 bp条带，PA317细胞未扩增出此特异性的条带(见图1)。以转染阳性的NIH3T3细胞的培养液进一步感染亲代细胞NIH3T3，未出现抗性细胞。
图1 各细胞培养上清液RNA的RT-PCR结果
←为mdr1 157bp 1.复华DNA Marker
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2.pAmdr1细胞 3.pA317细胞
三、逆转录病毒对T24细胞的转染 感染12 h之后换用筛选液(COL终浓主为60 ng/ml)，第2天出现大量的悬浮细胞，第7天基本无悬浮细胞出现。第4周开始有细胞增生，并出现细胞岛，转移其中较大的一个细胞岛至另一培养瓶中，继续COL筛选，将此克隆细胞命名为pT24mdr1。
四、细胞的生长曲线及生物学特性 同亲代细胞T24相比，pT24mdr1的形态无明显的变化，细胞内无明显的颗粒及空泡；二者的生长曲线大致相同，细胞倍增时间分别为24.2和25.1 h；两细胞的消化特性及培养条件也无差别。
五、细胞的耐药性 pT24mdr1细胞在ADM浓度小于0.78 μg/ml时，与T24细胞相比细胞存活率出现了显著性差异(P<0.01)，半数致死量(IC50)值分别为1.62、0.199 μg/ml。pT24mdr1细胞在COL浓度小于3000 ng/ml时，与T24细胞相比有显著性差异(P<0.01)，两细胞对COL的IC50值分别为740、33 ng/ml。
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六、免疫组化对细胞膜P-GP的检测 T24细胞染色为弱阳性，pT24mdr1细胞为强阳性染色。
七、原位杂交检测细胞内mdr1 mRNA的表达 pT24mdr1细胞可见很强的胞浆颗粒状着色，呈蓝紫色，主要位于细胞浆内，以核周染色较深。T24肿瘤细胞也可见到胞浆内蓝紫色的着色，较pT24mdr1染色明显浅淡(见封三图1)。
图1 pT24 mdr 1细胞原位杂交结果.(mdrl DNA探针)
八、PCR检测pT24mdr1细胞基因组中mdr1cDNA pT24mdr1细胞出现mdr1 cDNA的157 bp扩增条带，T24细胞则无此条带，见图3。
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图3 细胞基因DNA的PCR结果
1.pGEM-725(+)+HaeⅡ marker
2.pT24mdr1细胞 3.T24细胞
讨论
应用体外抗癌药物诱导方法建立MDR肿瘤细胞模型，能较好地模拟人类肿瘤化疗过程中经常发生的多药耐药现象，具有重要的意义[4]。但用此方法建立的MDR细胞系，诱导时间较长，诱导后细胞的生物特性与敏感细胞发生差异，当处于无化疗药物培养时稳定性较差，耐药性往往发生丢失[5]。我科于1994年应用大剂量ADM短暂冲击结合低浓度持续递增法建立的耐药细胞系[6]，再经连续观察3年，发现细胞耐药性丢失达70%。
生物转基因方法中，逆转录病毒载体是应用最广泛的载体之一。逆转录病毒的细胞感染率高，导入的基因拷贝数多，外源基因表达稳定。特别是该病毒仅能感染分裂相细胞，对生长分裂旺盛的肿瘤细胞更具有良好的选择性和转高的转移率[7]。本研究以DoTaP介导将携带mdr1基因的重组逆转录病毒载体pHaMDR1/A导入PA317包装细胞，并获得逆转录病毒上清液。NIH3T3细胞的培养上清液中未能扩增出mdr1的特异性的条带，再感染实验也表明无细胞克隆形成，即mdr1逆转录病毒上清液仅具有一次性的感染能力(无辅助病毒产生)。以上结果表明，此逆转录病毒上清液不仅含有mdr1基因，而且能安全、有效地应用于实验。
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本研究应用逆转录病毒载体系统介导的基因转移技术，将mdr1基因导入人膀胱癌细胞系T24，经用60 ng/ml秋水仙素选择性培养基筛选，建立了pT24mdr1细胞系。P-GP免疫细胞化学染色显示膀胱癌细胞T24呈现弱阳性染色，说明T24细胞有较弱的原发性耐药表型，能够表达一定量的P-GP。但细胞系pT24mdr1组化染色为强阳性，这说明pT24mdr1细胞在转基因之后P-GP的表达大量增加。原位杂交以mdr1 cDNA的酶切片段作为探针检测细胞mdr1 mRNA，结果表明，pT24mdr1细胞内mdr1 mRNA的表达量增加明显。尤其是pT24mdr1细胞系基因组DNA的PCR产物电泳显示，存在有mdr1 cDNA特异性的157bp扩增片段，这表明mdr1表达已整合到细胞基因组DNA。pT24mdr1细胞系也表现出较强的MDR表型，对COL的耐药性增高21倍，对ADM的耐药性增加8倍以上，较我科以药物诱导建立的耐药性细胞系BIU-87/ADM的耐药强度大大提高。从实验结果看，转入的mdr1基因得到了高表达，细胞的mdr1 mRNA及P-GP的表达量显著增加，细胞对化疗药物的耐药性也显著提高，从而证明mdr1基因编码的P-GP，是细胞产生多药耐药性的主要机制之一。
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本研究以秋水仙素作耐药性筛选，筛选成功后pT24mdr1细胞对秋水仙素的IC50为740 ng/ml，是耐药性筛选药物浓度60 ng/ml的10倍。半年内pT24mdr1细胞一直处于无化疗药物接触条件下培养，经消化传代近40次，该细胞的多药耐药性无明显降低，说明细胞的耐药性较稳定。本实验还显示转染基因前后的T24细胞形态、生长条件、细胞倍增时间以及消化特性等生物学特性均未发生明显的改变，证明逆转录病毒介导的基因转移对细胞的生物学特性并无影响。这种特性是药物诱导的MDR细系所不具备的。该细胞系的建立为深入研究MDR逆转提供了一个高效、稳定的细胞模型。
基金项目：本课题受97年国家自然科学基金资助。
作者简介：易善红，男，硕士，主治医师，讲师。
参考文献
[1]Roninson LB, Chin JE, Choi K, et al. Isolation of human mdr DNA sequences amplified in multidrug-ressistant KB carcinoma cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1986,83:4538
, http://www.100md.com
[2]Pastan I, Gottesman MM, Ueta K, et al. A retrovirus carrying an MDR1 cDNA confers multidrug resistance and polarized expression of P-glycoprotein in MDCK cells〔J〕. Proc Natl Acad USA,1988,85:4486
[3]何 斌，金锡御，杨唐俊，等.核酶对MDR1基因的体外割活性〔J〕.中华泌尿外科杂志，1999，1：23
[4]Kohichi K, Seiji N, Tsukasa S, et al. Establishment and characterization of doxorubicin resistance human bladder cancer cell line, KK47/ADM〔J〕^ J Urol,1992,148:441
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[5]Kiura K, Ohnoshi T, Tabata M, et al. Establishment of an adriamycin-resistant subline of human small cell lung cancer showing multifactorial mechanisms of resistance〔J〕. Acta Med Okayama,1993,47(3):191
[6]杨唐俊，杨清浩，范立新，等.人膀胱癌BIU-87细胞多药耐药性的形成〔J〕.中华泌尿外科杂志，1996，17(9)：527
[7]Miller AD. Human gene therapy comes of age〔J〕. Nature,1992,357:455
(收稿日期：1999-11-24；修回日期：2000-01-07), http://www.100md.com